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無血清細胞凍存液的操作方法

更新時間:2024-08-21      點擊次數(shù):116
  無血清細胞凍存液的操作方法主要包括細胞的收集、離心、凍存液的加入、分裝、凍存以及后續(xù)的解凍與復蘇等步驟。以下是詳細的操作方法:
  一、細胞的收集與離心
  細胞收集:
  使用常規(guī)方法收集處于對數(shù)生長期的懸浮細胞或貼壁細胞。對于貼壁細胞,可以使用胰酶或EDTA等試劑進行消化,使其從培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板表面脫落,然后收集到試管或離心管中。
  細胞離心:
  將收集到的細胞懸浮液置于離心管中,進行離心處理以收集細胞沉淀。離心條件通常為1,0002,000 rpm,4℃,持續(xù)35分鐘。注意,離心時應確保溫度適宜,以免對細胞造成損傷。
  離心結束后,小心移去離心管中的上清液,保留細胞沉淀。
  二、凍存液的加入與混合
  加入凍存液:
  向含有細胞沉淀的離心管中加入適量的無血清細胞凍存液。凍存液的加入量應根據(jù)細胞沉淀的體積和所需的細胞濃度來確定,通常使細胞濃度達到5×10^5至5×10^6 cells/ml或更高(如1×10^7/ml)。
  輕柔地混合均勻,避免產(chǎn)生過多的氣泡和剪切力,以免對細胞造成損傷。
  三、分裝與凍存
  分裝:

  將混合均勻的細胞懸液分裝到已標示

冷凍保存管中。建議每管分裝1ml或1.5ml的細胞懸液,以便于后續(xù)的使用和管理。

  凍存:
  將分裝好的細胞凍存管直接放入-80℃超低溫冰箱中進行冷凍保存。如果需要長期保存或運輸?shù)揭旱拗?,可以先?80℃冰箱中過夜或至少放置一天時間,然后再轉移到-196℃的液氮罐中。
  四、解凍與復蘇
  解凍:
  從冰箱或液氮罐中取出凍存的細胞管,立即放入37℃水浴槽中快速解凍。注意,解凍過程中應不斷搖動凍存管,以確保細胞懸液均勻受熱并盡快融化。
  復蘇:
  待細胞懸液融化后,立即加入適量的細胞培養(yǎng)基與細胞混合。然后,將混合液轉移到新的離心管中,進行離心處理以收集細胞沉淀(離心條件同上)。
  離心結束后,移去上清液,加入適量的新鮮細胞培養(yǎng)基重懸細胞。然后,將細胞懸液轉移到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中,置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。
  注意事項
  無菌操作:在整個操作過程中,應嚴格遵守無菌操作規(guī)程,以防止細胞污染。
  細胞狀態(tài):選擇處于對數(shù)生長期的細胞進行凍存,有助于提高復蘇后細胞的存活率和生長能力。
  凍存液成分:無血清細胞凍存液的成分和pH值對細胞凍存效果有重要影響。在選擇和配制凍存液時,應注意成分的搭配和pH值的合理性。
  凍存與解凍條件:凍存和解凍過程中的溫度和時間控制對細胞存活率至關重要。應遵循推薦的凍存和解凍條件進行操作。
  細胞密度:在凍存前和復蘇后,應注意檢查細胞的密度和生長狀態(tài),以便及時調整培養(yǎng)條件。

無血清細胞凍存液的操作方法

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